Dalia Seger Weizmann Forex

Alert Tr. im hat den Zugriff auf diesen Link aufgrund gefährlicher und unsicherer Inhalte blockiert. Das Tr. im-Team hat diesen Link für Ihre Sicherheit entfernt. Wir (Team Tr. im) arbeiten dafür, dass alle unsere Stakeholder unseren allgemeinen Geschäftsbedingungen und unseren allgemeinen Sicherheitsrichtlinien entsprechen. Bitte kontaktieren Sie supporttr. im für Fragen. Der Grund für diese Warnung besteht darin, dass der angeforderte Link auf der Tr. ims-Blacklist steht, für einen oder mehrere der folgenden Gründe: Der Link wurde so gekennzeichnet, dass er schädliche Inhalte wie Spamware oder Malware enthält. Der Link wurde mehrmals in einem anderen Link Shortener Service gekürzt. Der Link leitet zu einer bekannten Phishing-Site um. Der Benutzer wurde auf tr. im blockiert oder hat keine Konten-E-Mail bestätigt. Schließen Sie Ihre Registerkarte oder Browser Kürzen Sie die ursprüngliche URL mit Tr. imEvidence, die zeigt, dass die zweikettige Form von Vitronectin in der Leber durch eine selektive Furinspaltung produziert wird. Das adhäsive Protein Vitronectin (75 kDa) tritt in menschlicher Blutflüssigkeit in einer Einkette auf (Vn 75) oder einer zweikettigen Form (Vn 6510) und wird durch eine spezifische Spaltung (bei Arg 379 ndashAla 380) durch eine bislang nicht identifizierte Proteinase hergestellt. Diese beiden Formen erwiesen sich als funktionell unterschiedlich und daher kann diese Spaltung in vivo eine regulatorische Bedeutung haben. Hier berichten wir über die Verwendung einer maßgeschneiderten einkettigen rekombinanten Vn, eine spezifische Proteinkinase A-Phosphorylierung bei Ser 378. Die Sequenzanalyse zeigt, dass (1) keine der Proteine, die aus Blut stammen, die bisher als endogene Proteinase angesehen wurden, vorliegt (Plasmin, Thrombin, tPA und uPA) ist in der Tat die in vivo-Konvertase und (2) dass Furin, eine Serin-Endoproteinase, die sich im sekretorischen Weg von Hepatocyten befindet, wo Vn synthetisiert wird, spaltet Vn spezifisch an der endogenen Spaltstelle. Folglich schlagen wir vor, dass die Vn 75 bis Vn 6510-Umwandlung in der Leber stattfindet (nicht im Blut) und durch Furin durchgeführt wird. 1 Einführung Vitronectin (Vn) wurde als lsquoserum-Verbreitungsfaktor 1 entdeckt, es wird heute aber nicht nur als wichtiges adhäsives Glykoprotein in der extrazellulären Matrix, sondern auch als zirkulierendes Blut, aber auch als wichtiger Teilnehmer in einer Vielzahl anderer biologischer Substanzen betrachtet Funktionen. Dazu gehören Zelladhäsion, Ausbreitung und Migration, Blutgerinnung, Plasminogenaktivierung, Fibrinolyse und die Regulation der Komplementfunktion (2ndash5 und Literaturstellen darin). Vn ist in menschlicher Blutflüssigkeit in Konzentrationen von 200 bis 400 mg enthalten und stellt daher 0,2 bis 0,5 der gesamten Plasmaproteine ​​dar. Verringerte Plasmaspiegel von Vn wurden bei Patienten mit schwerer Leberinsuffizienz berichtet, was nahe legt, dass die Leber die Hauptquelle von Vn im Plasma 6,7 ​​ist. Im Blutkreislauf wird Vn in zwei molekularen Formen gefunden: eine einkettige Form von 75 kDa (Vn 75) und eine abgeschnittene Form (Vn 6510), die aus zwei Ketten (65 und 10 kDa) zusammengesetzt ist, die durch eine Disulfidbrücke 8 zusammengehalten werden. Die beiden Formen scheinen das Produkt von verschiedenen Genen zu sein, die sich in einer einzigen Aminosäure an Position 381 unterscheiden. Methionin an dieser Position bildet die V 75-Form, während Threonin in vivo eine Spaltung bewirkt (bei Arg 379 ndashAla 380) ) Und ergibt die Vn 6510-Form 9. Da Beweise gezeigt wurden, dass Vn aus Hep-G2-Zellen als einzelnes Kettenglykoprotein 10 sezerniert wird, scheint es vernünftig anzunehmen, dass diese Spaltung in der Blutflüssigkeit stattfindet. Mehrere Blutproteinasen wurden vorgeschlagen, um die Arg 379 ndashAla 380-Spaltung durchzuführen, jedoch wurde keines von ihnen rigoros (durch Sequenzanalyse) nachgewiesen, dass es die endogene Proteinase ist, die die Spaltung in vivo durchführt. Folglich wurde der Ort der endogenen Spaltung nicht eindeutig bestimmt. Unser Interesse, die Identität dieser endogenen Proteinase zu bestimmen, stammt aus unserer Feststellung, dass diese endogene Spaltung eine funktionell verschiedene Form von Vn ergibt. Zum Beispiel fanden wir, dass unter physiologischen Bedingungen Vn 6510 eine höhere Affinität für Heparin 11 und eine unterschiedliche Heparinabhängigkeit in seiner Phosphorylierung durch Proteinkinase A (PKA) 12 aufweist. Hier zeigen wir, dass Furin, eine Serin-Endoproteinase, die sich im sekretorischen Pfad der Hepatozyten befindet, selektiv diese Bindung spaltet und vorschlägt, dass die Umwandlung von Vn 75 zu Vn 6510 in der Leber stattfindet (vor der Sekretion) und nicht im Blut bisher. 2 Materialien und Methoden 2.1 Chemikalien und Enzyme Die folgenden Materialien wurden aus den kommerziellen Quellen Heparin Sepharose, Plasmin und alpha-Thrombin von Sigma gamma-32 PATP (3000 Cimmol) und 35 Smethionin aus Amersham-Nitrozellulosemembranen von Schleicher und Schuell t gekauft - PA und u-PA wurden von Calbiochem-rekombinanter N-Glycanase aus der Genzyme-Diagnostik gekauft, Furin wurde von Affinity Bioreagents (ABR) bezogen. 2.2 Andere Proteine ​​und Enzyme Vn wurden aus frisch gefrorenem menschlichem Plasma wie vorstehend beschrieben 8 gereinigt, wobei die Modifikationen routinemäßig in unserem Labor 11, 13 verwendet wurden. Die katalytische Untereinheit von PKA wurde nach dem von Beavo 14 beschriebenen Verfahren gereinigt. 2.3 Expressions - und Reinigungsrekombinante Vn Das exprimierte Protein wurde aus Medium von High-5-infizierten Zellen gesammelt und auf eine Heparin-Agarosesäule geladen, die zuvor mit 150 mM NaCl 50 mM TrisndashHCl (pH-Wert) äquilibriert worden war 7,5), alle bei 4 ° C. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Fraktionen wurden mit einem Gradienten von 150 mM bis 1 M NaCl in TrisndashHCl (pH 7,5) eluiert. Eluierte Fraktionen wurden durch Immunoblotting und Silberfärbung analysiert. Proben des Peaks wurden gepoolt und auf eine Zentrifugenmembranfiltervorrichtung (Millipore) konzentriert, wobei ein reiner und konzentrierter Vn (Thr-381) (0,5ndash1 mgml, bestimmt durch den Pierce-Proteintest) erhalten wurde. 2.4 Spaltung von Vn (Thr-381) durch verschiedene Blutproteasen (Thrombin, Plasmin, u-PA oder durch t-PA) Die Reaktionsmischung (180 mul) enthielt die folgenden Bestandteile bei den angegebenen Endkonzentrationen: Vn (27 mugml) , HEPES-Puffer (50 mM), pH 7,5 und eine der Proteinasen wie folgt: Thrombin (17,5 Uml), Plasmin (1,7 mugml), u-PA, t-PA (200 IU in 240 ml). Jede Reaktion wurde bei 37 ° C für die in der entsprechenden Figurenlegende angegebenen Zeiträume ablaufen gelassen. 2.5 Spaltung von Vn (Thr-381) durch Furin Das Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen 100 mul) enthielt die folgenden Bestandteile bei den angegebenen Endkonzentrationen: Vn (Thr-381) (20 mugml), HEPES-Puffer (100 mM), pH 7,5 , CaCl 2 (2 mM), beta-Mercaptoethanol (1 mM), Octyl-beta - D-glucopyranosid (0,1) und Furin (100 Uml). Die Reaktion ließ man bei 30 ° C für 20 h ablaufen. Aliquote wurden entfernt und durch PKA-Phosphorylierung (die spezifisch bei Ser 378 auftritt) und SDSndashPAGE mit Coomassie-Blau-Färbung analysiert, um die Spaltprodukte zu identifizieren. Die experimentellen Bedingungen, die für die Spaltung verwendet wurden, wurden von 16 angenommen. Es sollte angemerkt werden, daß die verlängerte Inkubation mit Vn notwendig war, um das Ausmaß der zur Analyse der Spaltprodukte benötigten Spaltung zu erhalten, vermutlich aufgrund der Tatsache, daß das verwendete Enzym a ist Rekombinantes Protein, und als solches könnte es nicht optimal gefaltet werden. Es könnte auch darauf zurückzuführen sein, dass sich Furin in der Zelle in einem Membranmilieu befindet, das wir in einer wässrigen Lösung nicht ausreichend nachahmen können. 2.6 Phosphorylierung von Vn (Thr-381) durch PKA Die Phosphorylierungs-Assaymischung (50 mul) enthielt die folgenden Bestandteile bei den angegebenen Endkonzentrationen: Vn (Thr-381) (11 mugml), die C-Untereinheit von PKA (3 mugml) , Magnesiumacetat (20 mM), gamma 32 PATP (10 mMM 6 Cimmol), HEPES-Puffer (20 mM, pH 7,5) und Heparin (10 mugml). Die Reaktion ließ man bei Raumtemperatur für 30 min ablaufen und wurde durch Zugabe von 17 ml 4 × - konzentriertem Laemmlis-Probenpuffer arretiert und für 3 min siedet. Danach wurden die Proben SDSndashPAGE unterworfen, die Gele wurden dann getrocknet und einer Röntgenographie ausgesetzt. 2.7 Western Blots Analyse von Vn (Thr-381) Die Blots wurden mit polyklonalem alpha-Vn-Antiserum, gefolgt von Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, untersucht. Die Banden wurden durch ECL visualisiert. 2.8 Sequenzierung der 10-kDa-Bande, die durch Furinspaltung von Vn (Thr-381) erzeugt wurde. Furin-gespaltenes Vn (Thr-381) wurde auf 12,5 PAGE vorab 10 min lang mit 5 mM Natriumthioglykolat im Laufpuffer gefahren. Das Gel wurde unter Verwendung einer Bio-Rad-Nassüberführungsvorrichtung auf eine PVDF-Membran übertragen. Die Banden wurden durch leichte Coomassie-Blau-Färbung (in 50 Methanol und 5 Essigsäure für 5 Sekunden 10 Minuten) sichtbar gemacht, gefolgt von Entfärben in 50 Methanol. Die 10-kDa-Bande, die aus der getrockneten Membran herausgeschnitten wurde, wurde in einem Procise-Proteinsequenzierer 491 von Applied Biosystems sequenziert. 2.9 Herstellung der Vn (1ndash379) - Mutante und der Vn (S378A) - Mutante Die Vn (1ndash379) - Mutante wurde durch Insertion eines Stopcodons nach R 379 erzeugt. Unter Nutzung der beiden Msc1-Stellen (332 Basenpaare auseinander) einer PCR Fragment wurde unter Verwendung eines Sense-Oligonukleotids stromaufwärts von der ersten Msc1-Stelle und eines Antisense-Oligonukleotids stromabwärts der zweiten Msc1-Stelle, die eine TAA-Stop-Codon-Insertion (unterstrichen) enthielt, erzeugt. Die Antisense-Oligonukleotidsequenz war: 5pr-GGA-TGG-CCA-CGT-GCG-GGA-TGG-CCG-3prim. Das PCR-Produkt wurde mit Msc1 verdaut und in Msc1 verdautes Vn (Thr-381) - pRSET subkloniert. Die S378A-Punktmutation in Vn wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von Vn (Thr-381) cDNA (in pGEX 2T) als Matrize erzeugt. Das Sinn-Oligonukleotid war: 5prim-TCC-CGC-CGG-CCA-GCC-CGC-GCC-3prim. Das aus dem Vektor-pGEX 2T konstruierte Antisense-Oligonukleotid war: 5prim-CGT CAG TCA GTC ACG ATG AAT TC-3prim. Gereinigte PCR-amplifizierte Fragmente, die mit Nae I und Eco RI verdaut wurden, wurden in Vn (Thr-381) - pGEX-2T, verdaut mit Nae I und Eco RI, ligiert. Beide Konstrukte wurden sequenziert, um zu bestätigen, dass die Amplifikation korrekt war, bevor eine weitere Subklonierung in den Transfervektor von PVL 1393 (BamHI und EcoRI-Stellen) erfolgte. Erzwungene Rekombination in die virale DNA und weitere Verfahren für die Expression wurden wie zuvor beschrieben 15 durchgeführt. 3 Ergebnisse und Diskussion 3.1 Expression, Charakterisierung und Reinigung des in dieser Studie verwendeten Vn (Thr-381) Zur Identifizierung der endogenen Proteinase, die Vn an der Arg 379 ndashAla 380-Bindung klammert, wurde ein rekombinantes Vn mit Thr in Position 381 (Vn (Thr-381)), wie in der physiologischen Vorstufe der zweikettigen Form von Vn. Dieses rekombinante Vn (MW sim70 kDa (1A)) wurde in High-5-Insektenzellen exprimiert und unter Verwendung seines eigenen Signalpeptids in das wachsende Medium sezerniert. Das sezernierte Protein wurde als ein einkettiges Protein mit einer reduzierten Molekülgröße (70 anstelle von 75 kDa) am wahrscheinlichsten aufgrund einer unvollständigen Glycosylierung in den Insektenzellen gefunden. Tatsächlich wurden bei der enzymatischen Deglykosylierung sowohl das Vn (Thr-381) als auch die aus Plasma isolierte einkettige Form von Vn (75 kDa) zusammenwachsen, wenn sie parallel zueinander verlaufen (1B). Daher ist das rekombinante Vn, das einen Thr-Rest an Position 381 enthält und nicht in den High-5-Zellen abgeschnitten ist, ein geeignetes Substrat für die Identifizierung der endogenen Proteinase, die Vn an ihrer Arg 379 ndashAla 380-Bindung spaltet. Das von infizierten Hoch-5-Zellen-Medium gesammelte Vn (Thr-381) wurde auf einer Heparin-Agarose-Säule gereinigt und die eluierten Fraktionen wurden durch Immunoblotting und Silberfärbung analysiert und als rein dargestellt (1C). Die Proben aus den Peak-Fraktionen wurden gepoolt und auf 0,5 bis 20 ml konzentriert, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Reinigung und Charakterisierung von Vn (Thr-381), ausgedrückt in einem Baculovirus-System. (A) Expression von Vn (Thr-381) in High-5-Insektenzellen: Vn wurde in mit Baculovirus infizierten High-5-Zellen exprimiert. Proben von Medium, das sezerniertes Vn (Thr-381) enthielt, wurden durch Immunblot unter Verwendung von anti-human Vn polyklonalen Antikörpern analysiert. Vn (Thr-381) (Spur 3) von nicht-infizierten High-5-Zellen (Spur 2) und Vn, gereinigt aus menschlichem Plasma (Spur 1). (B) Deglykosylierung von Plasma Vn und von Vn (Thr-381), exprimiert in High-5-Zellen. Medium einer Probe, die sezerniertes Vn (Thr-381) (Bahn 1) oder eine Probe von Vn (Bahn 2) enthält, aus Plasma gereinigt. Proben (jeweils 0,5 mug) wurden bei 56 ° C für 15 min denaturiert, dann mit 1 U N-Glycanase in 100 mM Tris-Puffer, pH 8,6 (gesamte Reaktionsmischung 100 & mgr; l) für 2 h bei 37 ° C behandelt. Die Proben wurden durch Immunoblotting unter Verwendung von anti-human Vn polyklonalen Antikörpern analysiert. (C) Reinigung von Vn (Thr-381), exprimiert in High-5-Insektenzellen. Vn (Thr-381), gesammelt aus Medium von High-5-infizierten Zellen, wurde auf eine Heparin-Agarosesäule geladen, die zuvor mit 150 mM NaCl 50 mM TrisndashHCl (pH 7,5), alle bei 4 ° C, äquilibriert worden war. Danach wurde die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen und die Fraktionen wurden mit einem Gradienten von 150 mM bis 1 M NaCl in einem TrisndashHCl-Puffer (pH 7,5) eluiert. Aliquote aus den angegebenen Fraktionen wurden gekocht (5 min in Laemmlis-Probenpuffer) und auf SDSndashPAGE (10 Acrylamid) beladen. Die Gele wurden durch Silberfärbung (oberes Gel) analysiert und durch Immunoblotting mit anti-Vn polyklonalen Antikörpern (unteres Gel) analysiert. P, anziehen, waschen. 3.2 Vn (Thr-381) wird nicht durch Proteinasen gespalten, die im Blut gefunden wurden. Auf der Basis der ungefähren MW der Spaltprodukte, die aus Plasma Vn durch einige basophile Proteinasen erhalten wurden, wurde angenommen, dass entweder die Plasmin, tPA oder uPA die natürliche endogene Proteinase sind Für die Spaltung der Arg 379 ndashAla 380-Bindung in Vn. Die Identifizierung und Charakterisierung dieser endogenen Proteinase zog weiter unsere Aufmerksamkeit auf sich, als wir feststellten, dass die einkettigen und die zweikettigen Formen von Vn sich in ihren Eigenschaften in einer Weise unterscheiden, die einen Unterschied in ihrer physiologischen Funktion 11,12 andeuten könnte und a Unterschiedliche regulatorische Rolle im Blut. Wenn ja, könnte die Proteinase sogar ein interessantes pharmakologisches Ziel darstellen. Die Bestimmung des Locus, in dem diese Spaltung auftritt, ist auch insofern von Bedeutung, als das Blut selbst, wie es bisher angenommen wurde, oder die Leber, von der bekannt ist, daß die Biosynthese von Vn stattfindet. Bei der Suche nach der endogenen Proteinase verwendeten wir: 1) eine einkettige rekombinante Vn, die Thr in Position 381 (Vn (Thr-381)) wie in der natürlichen Vorstufe der zweikettigen Vn-Form enthält, sowie a (2) die selektive Phosphorylierung von Ser-378 mit PKA (3) die Konsensussequenz für die Spaltstelle von jeder Proteinase und VN (Vn (S378A)) (4) eine rigorose Bestimmung der genauen Schnittstelle jeder vermuteten Proteinase durch Aminosäuresequenzierung oder durch Massenspektrometrie der Spaltprodukte und nicht nur durch Bestimmung der ungefähren Molekülgröße des Spaltprodukts / der Spaltprodukte mit SDSndashPAGE Dass Plasmin das in Blutflüssigkeit an der Arg-361-ndashSer-362-Bindung gefundene Vn spaltet, was ein 12-kDa-radioaktiv markiertes Fragment 17 ergibt. Allerdings wurde die Möglichkeit untersucht, dass alle spaltbaren Vn im Blut mit einem Thr an Position 381 bereits abgeschnitten wurden und Dass die Plasmin-Spaltung an der Arg 361 ndashSer 362-Bindung, die das 12-kDa-radioaktiv markierte Fragment lieferte, die Plasmin-Spaltung der Vn-Moleküle mit einem Met an Position 381 darstellt (um die Möglichkeit zu untersuchen, dass Plasmin auch an Arg 379 ndashAla 380 spaltet Eine Kette Vn mit einem Thr an der Position 381 (Vn (Thr-381)). Wenn Plasmin dieses Vn an Arg 379 ndashAla 380 spaltet, sollten wir eine 2-kDa-radioaktiv markierte Bande des Phosphopeptids 361ndash379 anstatt des 12-kDa-Fragments des Segments 362ndash459 erhalten (siehe Schema 1A zur Größenvorhersage). Schematische Darstellung der Schnittstellen und Lokalisierung der nach Exposition gegenüber Blut-Proteinasen und anschließender Phosphorylierung mit PKA bei Ser 378 erzeugten proteolytischen Fragmente. (A) Die nach Plasmin - oder Thrombin-Spaltung erzeugten Vn-Spaltprodukte. Basierend auf den bereits bekannten Stellen der Spaltung durch Plasmin 17 und Thrombin 18. haben wir vorausgesagt, dass die radioaktiv markierten Fragmente des gespaltenen Vn (Thr-381), die in dieser Studie verwendet wurden, ein 12-kDa-radioaktiv markiertes Fragment mit den Resten 362ndash459 sein sollten Spaltung an der endogenen Schnittstelle (Arg 379 ndashAla 380) und ein radioaktiv markiertes 2-kDa-Fragment, das den Resten 362ndash379 entspricht, wenn Plasmin auch an dieser Stelle spaltet. In ähnlicher Weise erhielten wir, basierend auf den bekannten Stellen der Thrombin-Spaltung in Vn, ein 17-kDa-radioaktiv markiertes Fragment, das aus dem 305ndash459-Segment in Vn stammt, wenn Thrombin die endogene Spaltstelle (dh die Arg 379 ndashAla 380-Bindung) nicht spaltet, Und nur ein 7-kDa-Fragment, das den Resten 305ndash379 in Vn entspricht, wenn Thrombin diese Stelle spaltet. (B) Die nach seiner Verdauung mit Furin erzeugten Vn-Spaltprodukte. Wenn Furin Vn an der Arg 379 ndashAla 380-Bindung spaltet, erwarten wir, ein radioaktivierbares 60-kDa-Fragment zu erzeugen, das dem 1.ash379-Segment entspricht, das das PKA-phosphorylierte Ser 378 enthalten sollte. Feige. 2 zeigt die Exposition von Vn (Thr-381) gegenüber vier Proteinasen, die im Blut aktiviert werden. Es ist offensichtlich, dass während der Plasmin - und Thrombinspaltung Vn (Thr-381) (2A, B) nicht u-PA und t-PA es nicht spalten (2C). Wenn Vn (Thr-381) Plasmin für die Erhöhung von Zeitspannen ausgesetzt wird und dann einer Phosphorylierung durch PKA unterworfen wird, wird ein sim12-kDa-abgeschnittenes Produkt gebildet, das durch radioaktiv markiertes ATP und PKA als radioaktiv markiert wurde (2A oben) Panel). Die Phosphorylierung von Vn durch PKA wurde zuvor als ortsspezifisch mit Vn identifiziert, das aus Plasma 12 isoliert wurde. Trotzdem wurde dies hier mit dem in unserer Untersuchung verwendeten rekombinanten Substrat bestätigt, indem gezeigt wurde, dass, wenn Ser-378 zu Ala mutiert ist, es ist Nicht phosphoryliert durch PKA (2A, B). Da bei der Spaltung mit Plasmin die Radiomarkierung im kleinen Fragment (12 kDa) gefunden werden kann, konnten wir schließen, dass Plasmin Vn nicht an der Arg 379 ndashAla 380-Bindung spaltet, da die Ser 378-Phosphorylierungsstelle dieser Bindung vorausgeht (siehe Schema 1). Identifizierung der Vn-Spaltprodukte nach der Verdauung durch Proteinasen, die aus der Blutflüssigkeit stammen. (A) Überwachen der Plasmin-Spaltung. Vn (Thr-381) oder Vn (S378A) wurden mit Plasmin verdaut (Details siehe Abschnitt 2). Die Spaltprodukte wurden durch PKA-Phosphorylierung (eine Stelle in Vn bei Ser 378) gezeigt, die bei 22 ° C für 30 Minuten in Gegenwart von & ggr; 32 PATP durchgeführt wurde. Die Reaktion wurde durch 5-minütiges Kochen in Laemmlis-Probenpuffer und Beladen auf SDSndashPAGE (10 Acrylamid) beendet. Die Gele wurden getrocknet und der Autoradiographie (oberes Gel) ausgesetzt oder auf Nitrozellulosemembranen übertragen und mit humanen anti-Vn-polyklonalen Antikörpern blotiert (unteres Gel). (B) Überwachung der Thrombinverdauung. Vn (Thr-381) wurde durch Thrombin verdaut (Details siehe Abschnitt 2). Die Spaltprodukte wurden, wie in A. beschrieben, offenbart. (C) Überwachen des u-PA - und t-PA-Aufschlusses. Vn (Thr-381) wurde durch u-PA oder t-PA verdaut (Details siehe Abschnitt 2). Die Spaltprodukte wurden offenbart, wie in A beschrieben. Wir haben zuvor gezeigt, daß Thrombin Vn bei Arg 305 ndashThr 306 und bei Arg 370 ndashAsn 371 18 spaltet. Wenn Thrombin auch an der endogenen Spaltstelle (Arg 379 ndashAla 380) Vn spaltet, Würde erwarten, ein 7-kDa-radioaktiv markiertes Band zu erhalten, das aus dem Segment 305ndash379 stammt (siehe Schema 1A). Tatsächlich wurde ein solches markiertes Peptid gebildet (2B oberes Feld). Jedoch zeigte die massenspektrometrische Analyse der gespaltenen Fragmente, daß dieses Peptid als Ergebnis einer zusätzlichen Thrombin-Spaltstelle (bei Arg 444 ndashSer 445., die vorher nicht berichtet wurde) gebildet wurde, die ein radioaktiv markiertes Peptid mit 371 endash444 ergibt. 3.3 Furin spaltet die Arg 379 ndashAla 380-Bindung in Vn selektiv. Angesichts der Tatsache, dass keine der untersuchten Plasmaproteasen Vn an der endogenen Spaltstelle spalten konnte, wurde die Möglichkeit untersucht, dass die Proteinase Vn bereits während ihrer Herstellung spalten kann die Leber. Wir betrachteten diese Möglichkeit trotz der Tatsache, dass frühere Berichte gezeigt haben, dass Vn aus Hepatomzellen in ihrer Einzelkettenform (MW von 75 kDa 10) sezerniert wird. Diese Überlegung basierte auf einem weiteren Bericht, von dem man ableiten konnte, dass während Vn-Produktion in Hep G2 beide Formen von Vn (die eine Kette (Vn 75) und die zwei Kettenformen (Vn 6510) sekretiert werden. Eine ähnliche Beobachtung wurde auch in unserem Labor durchgeführt (Z. Gechtman und S. Shaltiel, unveröffentlichte Ergebnisse). Angesichts dessen haben wir versucht, festzustellen, ob die Spaltung von Vn bei Arg 379 ndashAla 380 in der Leber vor der Sekretion erfolgt, beispielsweise von einem Mitglied der Leberfamilie von Proenzym-Convertasen (PCs), von denen bekannt ist, Den sekretorischen Weg der Hepatozyten. Die Kandidaten-Proteinase, die ausgewählt wurde, war Furin, aus den folgenden Gründen: (1) es wurde zuvor gezeigt, daß es in Hep G2-Zellen und in normalen Hepatocyten 20 stark exprimiert wird und sich im trans-Golgi-Netzwerk befindet, wo es eine breite Vielfalt von Proenzymen spaltet 21 (2) ist es kommerziell in einer rekombinanten Form erhältlich und am wichtigsten, (3) seine Spezifität ist am besten geeignet, um die endogene Spaltung von Vn bei R 376 PSR darr A 380 herbeizuführen. Es ist anzumerken, dass die minimale Konsensussequenz für die Spaltung von Furin RXXR darr 16 an drei verschiedenen Stellen in Vn gefunden wird (R 361 SQR darr G 365. bei R 376 PSR darr A 380. und bei R 431 TRR darr V 435). In einer Studie, bei der die Sequenzen verschiedener Protein-Substrate, die konstitutiv durch Furin verarbeitet wurden, untersucht wurden, zeigte sich, daß die Spaltung bei R darr A eine hohe Präferenz aufwies. Beispielsweise wurden aus 34 Vorläuferproteinen, die durch Furin verarbeitet wurden, 10 an einer ArgndashAla-Stelle gespalten, nur zwei wurden an einer ArgndashGly-Stelle gespalten, und keiner wurde an einer ArgndashVal-Stelle 22 gespalten. Unter Ausnutzung der spezifischen PKA-Phosphorylierung von Vn bei S 378 und der Tatsache, dass die optimale Konsensussequenz für die Furinspaltung bei R 376 PSR darr A 380 liegt. Wir erwarteten, dass, wenn Furin tatsächlich die endogene Proteinase ist, die Spaltung von Vn (Thr-381) ein radioaktiv markiertes Produkt mit einem & bgr; MW von sim60 kDa (die radioaktive Markierung, die von S 378 stammt). Wie in Fig. 3A (Spuren 2 und 3), ist dies tatsächlich der Fall: das erhaltene Spaltprodukt wanderte mit der trunkierten Mutante Vn (1ndash379) zusammen. Um eine rigorose Identifizierung der Spaltstelle zu erhalten, wurde nach dem sim10 kDa (nicht markierten) Spaltprodukt gesucht, das auch als Folge der Furinspaltung gebildet werden sollte, um es zu sequenzieren und die Spaltstelle eindeutig zu etablieren. Dazu wurde die Reaktionsmischung SDSndashPAGE unterworfen und mit Coomassie-Blau gefärbt, wobei die niedrigen MW-Produkte (lt30 kDa) fokussiert wurden. Wie in Fig. 3B nach Spaltung mit Furin erhielten wir zwei Banden (I und II). Band I hatte genau die Sequenz, die dem freien N-Terminus entspricht, der als Ergebnis der endogenen Spaltung gebildet werden soll (Tabelle 1). Zusätzlich beobachteten wir häufig eine zusätzliche Bande (Band II in Abb. 3B, Spur 2). Die relative Menge von Band II variierte von einem Experiment zum anderen und unsere Versuche, seine Struktur positiv zu identifizieren, scheiterten bisher. Wir fanden jedoch, dass es einen blockierten N-Terminus hat und daher auch dann, wenn es von Vn stammt, nicht aus der Nähe der endogenen Schnittstelle stammen kann (siehe Schema 1). Furin spaltet Vn an der Arg 379 ndashAla 380-Bindung, was zu Vn 6510 führt. Das rekombinante Vn (Thr-381) wurde für 20 h bei 30 ° C durch Furin verdaut. Die Spaltprodukte wurden durch PKA-Phosphorylierung (wie in Fig. 2 beschrieben) und (B) durch Coomassie-Blau-Färbung offenbart (A), wobei die niedrigen MW-Banden von Vn (Thr-381) verglichen wurden. Die Produkte von Furin-verdautem Vn (Thr-381) (Spur 2, A und B) wurden mit identischen, jedoch ohne Furin (Spur 1, A und B) inkubierten Vn (Thr-381) und mit Vn 1ndash379) gekürzte Mutante, in die ein Stopcodon nach der endogenen Spaltstelle eingeführt wurde, um das Polypeptidsegment 1ndash379 (A, Spur 3) zu ergeben. Tabelle 1: Sequenzanalyse der 10-kDa-Bande, die aus der Vn (Thr-381) - Spaltung durch Furin resultiert Die Ausbeute war für die quantitative Bestimmung wegen der Labilität von Tryptophan während der sauren Hydrolyse zu niedrig. 3.4 Schlussbemerkungen Die in diesem Bericht dargestellten Ergebnisse zeigen, dass keine der zuvor für die Spaltung der Arg 379 ndashAla 380-Bindung vorgesehenen Serumproteasen die endogene Proteinase ist (sie spalten alle in der Nähe dieser Bindung, aber nicht an der Bindung selbst). Furin, eine kalziumabhängige Serin-Endoprotease, die sich im sekretorischen Pfad der Hepatocyten befindet, spaltet diese Bindung spezifisch und kann somit die endogene Proteinase sein, die für die physiologische Spaltung der Einketten in die zweikettige Form von Vn verantwortlich ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse schlagen wir vor, dass die Vn 75 bis Vn 6510-Umwandlung in der Leber vor der Sekretion stattfindet, nicht im Blut, wie bisher vorgeschlagen. Dieser Befund stellt die Voraussetzung für einen tieferen Einblick in die physiologische (möglicherweise regulatorische) Signifikanz der Vn 75 bis Vn 6510-Umwandlung dar und identifiziert ein potentielles Zielenzym für pharmakologische Intervention. Danksagungen S. S. ist der Amtsinhaber des Kleeman Lehrstuhls für Biochemie. Diese Forschung wurde von der Israel Science Foundation unterstützt. Artikel PDF-Dokument Seite drucken PDF Drucken E-Mail FEBS Briefe 480 (2000) 1873-3468 Exemplar 2015 Verband der europäischen Biochemischen Gesellschaften Vitronectin Furin Adhesive Protein Fibrinolyse Heparin Extrazelluläre Matrix Publikationsverlauf Ausgabe online: 30 August 2000 Version vom Rekord: 30 August 2000 Manuskript Akzeptiert: 28. Juli 2000 Manuskript Überarbeitet am: 26. Juli 2000 Manuskript erhielt: 26. Mai 2000 Referenzen Weiterführende Inhalte Artikel zu der von Ihnen gesuchten Seite Aktivieren Sie bitte Javascript, um den entsprechenden Inhalt dieses Artikels anzusehen.